PCR反应条件的调节方面的介绍哪里会有介绍?生物技术方面的知识在哪里可以了解

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PCR反应条件的调节方面的介绍哪里会有介绍?生物技术方面的知识在哪里可以了解

温度与时间的设置:

基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40 ~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。

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 变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。DNA在其链分解温度时的变性只需几秒钟,但反应管内达到Tss还需一定时间,变性温度太高会影响酶活性;通常情况下93℃~94℃1min足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。变性所需的加热温度取决于模板及PCR产物双链DNA中的G+C含量。双链DNA中的G+C的比率越高,则双链DNA分离变性的温度也就越高。变性所需的时间与DNA分子的长度相关,DNA分子越长,在特定的变性温度下使双链DNA分子完全分离所需的时间就越长。若变性温度太低或变性时间太短,则只能使DNA模板中富含AT的区域产生变性,当PCR循环中的反应温度降低时,部分变性的DNA模板又重新结合成双链DNA,从而导致PCR的失败。

可以参考:

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退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。复性温度决定着PCR的特异性.引物复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。一般退火温度在40~60℃之间,时间为30~45s,足以使引物与模板之间完全结合。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。如果(G C)低于50%,退火温度应低于55℃。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:

Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T) 复性温度=Tm值-(5~10℃)

【引物长度在15~25bp可通过公Tm=(G C)×4℃ (A T)×2℃计算退火温度】:

较高的退火温度可提高反应的特异性。在Tm值允许范围内,应尽量选择较高的复性温度。

延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性:70~80℃ 150核苷酸/S/酶分子;70℃ 60核苷酸/S/酶分子;55℃ 24核苷酸/S/酶分子;高于90℃时, DNA合成几乎不能进行。

延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内,一般在70~75℃。常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定,通常对于1kb以内的片段1min是够用的。3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。

求关于电影《恐怖游轮》的剧情解析?

 这个故事的主题是一个不愿承认自己死去的灵魂做的徒劳的抗争,她对朋友的关切、对儿子的牵挂乃至后来近乎决绝的疯狂抗争都无法改变自己已经死亡的事实,她渴望违背自然法以恢复失去的生命,恢复失去的爱,渴望弥补自己曾经带给儿子的伤害。而这一切都注定了她将陷入自己的心造出的炼狱,无止境的循环下去。

影片中反复出现明朗的画面,碧蓝的天空,明媚的阳光,清澈的海水,显示出一幅美好的图景,然而很难想象,这样的世界却是一个人死后的境遇,连海鸥的鸣叫都那么恐怖而幽怨,到处弥漫着无法摆脱的恐惧和痛苦。

所以这个故事的全貌大致如下:【】

周六早上,Jess带着儿子去赴Greg八点半的约一起出海(冰箱上的纸条写着 :Greg,the trangle harbor 8:30,是她提醒自己用的),但是因为儿子弄洒了颜料耽误了时间,所以Jess为了不迟到开了快车,导致车祸,母子二人当场死去,死亡时间是8:17分,也就是Jess手表和船上的挂钟永远停止的时间。Jess的灵魂在弥留之际记得有一个约还没有赴,所以请求死神带她去港口见Greg一面以了牵挂,她承诺死神一定会回来赴死,但是却违背了承诺一去不回,于是有了后面的降罪。

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